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猪血管内皮生长因子(VEGF)ELISA试剂盒

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猪血管内皮生长因子(VEGF)ELISA试剂盒

 (用于血清、血浆、细胞培养上清液和其它生物体液内)

 

原理

本实验采用双抗体夹心 ABC-ELISA法。用抗猪 VEGF 单抗包被于酶标板上,标准品和样品中的 VEGF与单抗结合,加入生物素化的抗猪VEGF,形成免疫复合物连接在板上,辣根过氧化物酶标记的Streptavidin与生物素结合,加入底物工作液显蓝色,最后加终止液硫酸,在450nm处测OD值,VEGF浓度与OD值成正比,可通过绘制标准曲线求出标本中VEGF浓度。

试剂盒组成2-8保存)

酶标板(Coated Wells

96

酶标抗体工作液(Enzyme Conjugate

12ml

10×标本稀释液(Sample Buffer

12ml

20×浓缩洗涤液(Wash Buffer

50ml

标准品(Standards):40ng/

2

底物工作液(TMB Solution

12ml

第一抗体工作液(Biotinylated Antibody

12ml

终止液Stop Solution

12ml

准备试剂与收集血样

1.         收集标本:血清、血浆(EDTA)、细胞培养上清液、组织匀浆等尽早检测,2-8保存48小时;更长时间须冷冻(-20 ℃-70 ℃)保存,避免反复冻融。

2.         标准品液配制:使用前加入1ml蒸馏水混匀,配成40ng/ml的溶液设标准管8管,第一管加标本稀释液900ul,第二至第八管加入标本稀释液500ul。在第一管中加入40ng/ml的标准品溶液100ul混匀后用加样器吸出500ul,移至第二管。如此反复作对倍稀释,从第七管中吸出500ul弃去。第八管为空白对照。

3.         10×标本稀释液用蒸馏水作1:10倍稀释(示例:1ml浓稀释液+9ml蒸馏水)。

4.     洗涤液:用重蒸水1:20稀释(示例:1ml浓缩洗涤液加入19ml的重蒸水)

检测程序

1.         加样:每孔各加入标准品或待测样品100ul,将反应板充分混匀后置37120分钟。

2.         洗板:用洗涤液将反应板充分洗涤4-6次,向滤纸上印干。

3.         每孔中加入第一抗体工作液100ul。将反应板充分混匀后置3760分钟。

4.         洗板:同前。

5.         每孔加酶标抗体工作液100ul。将反应板置3730分钟。

6.         洗板:同前。

7.         每孔加入底物工作液100ul,置37 暗处反应15分钟。

8.         每孔加入100ul终止液混匀。

9.         30分钟内用酶标仪在450nm处测吸光值。

结果计算与判断

1.         所有OD值都应减除空白值后再行计算。

2.         以标准品40002000100050025012562.50 pg/ml为横坐标,OD值为纵坐标,在坐标纸上作图,画出标准曲线。

3.         根据样品OD值在该曲线图上查出相应VEGF含量。

试剂盒性能

        1.   灵敏度最小的VEGF 检测浓度小于30pg/ml

2.   特异性:可同时检测重组或天然的猪VEGF不与猪其它细胞因子有交叉反应。

3.   重复性:板内、板见变异系数均小于10%。

注意事项

        1.   以上标准孔及待测样品均建议做复孔,每次测定应同时做标准曲线。

 2.   洗涤过程很关键。洗涤不充分将导致精确度误差及OD值错误地升高。

        3.   板条开封后剩余板条要再封好,保持板条干燥

        4.   本试剂盒宜置4oC冰箱保存。

 5.   本试剂盒仅用于科研,不能用于临床诊断。